Setelah sebelumnya membahas mengenai macam macam / jenis dari kromatografi, kali ini saya akan membahas mengenai dasar teori mengenai kromatrografi cair kinerja tinggi (KCKT) atau yang lebih lazim disebut dengan HPLC (High Performance Liquid Chromatography).
Gambar tersebut diatas merupakan ilustrasi dari sebuah kromatogram yang biasanya dihasilkan dari hasil analisa menggunakan HPLC, tentunya dalam kenyatannya peak yang dihasilkan tidak sebagus dalam gambar tersebut.
Mari kita bahas satu persatu pengertian dari gambar kromatogram diatas :
1. Lebar peak (W) merupakan jarak antara awal dan akhir peak) sedangkan W 1/2 adalah lebar peak pada setengah tinggi peak itu sendiri.
Didalam peak itu sendiri kita jika kita bagi 2 kita bisa melihat lebar peak pada ketinggian 10 % dihitung mulai dari awal peak sampai dengan puncak peak (di dalam gambar dilambangkan dengan huruf A dan B),Kedua parameter ini (A dan B) akan muncul dalam perhitungan peak asymetri, apakah peak tersebut simetric, fronting, atau tailing.
Peak Asymetri dihasilkan dari angka banding B/A (lihat gambar diatas)
2. Waktu Retensi
to (dead time) merupakan waktu retensi dimana senyawa tidak terpengaruh oleh kolom atau dengan kata lain waktu yang diperlukan senyawa yang tidak berinteraksi dengan fase diam dalam kolom mulai injeksi sampel sampai ke detektor.
tr1 dan tr2 merupakan waktu retensi total senyawa pertama dan kedua atau waktu yang diperlukan senyawa sejak injeksi sample sampai muncul tinggi peak maksimum yang terdeteksi di dalam detektor.
t’r1 dan t’r2 merupakan waktu retensi sebenarnya dari senyawa pertama dan kedua atau selisih waktu retensi total untuk senyawa bersangkutan dengan dead time. Jika dirumuskan maka
t’r1 = tr1 – to dan
t’r2 = tr2 – to
Dimana waktu tersebut dalam satuan menit.
3. Faktor Kapasitas
Dilambangkan dengan huruf k’ yang menyatakan suatu ukuran dari posisi senyawa yang bersangkutan didalam kromatogram terhadap senyawa inert dan tergantung dari fase diam, fase gerak, temperature serta kualitas dari kolom itu sendiri. RUmus dari faktor kapasitas adalah
K’ = (tr – to) / to
Nilai k’ ini selalu dihubungkan dengan efektifitas metode analisa. nilai k rendah berarti peak tersebut terlalu cepat keluar demikian juga sebaliknya.
4. Retensi Relatif
Merupakan perbandingan dari 2 faktor kapasitas yang sudah dijelaskan dalam nomor 3. Sering juga disebut sebagai faktor pemisahan atau selektifitas dimana mengindikasikan kemampuan fase diam dan fase gerak dalam memisahkan 2 senyawa.
Retensi relatif = k’2 / k’1
5. Resolusi
Merupakan besarnya pemisahan diantara senyawa yang berturutan dan dirumuskan seperti dibawah ini
6. Laju alir linier fase gerak
Dilambangkan dengan huruf “u” dan dirumuskan dengan
u = L / to
7. Permeabilitas (K)
Ukuran dari kemampuan kolom untuk melewatkan fase gerak dan menentukan ketahanan kolm tersebut terhadap tekanan dimana nilainya ditentukan oleh fase gerak, temperature, panjang kolom dan tekanannya.
8. Plat Teoritis
Jumlah plat teoritis ini menunjukkan kualitas bahan packing. nilai plat teoritis yang besar menunjukkan kemampuan memisahkan campuran yang komplek juga semakin besar.
9. HETP
Satuan panjang dimana terjadi keseimbangan kromatografi dirumuskan dengan L (panjang kolom) / n (plat teoritis).
Peak Tailing dan Fronting
Peak tailing dan Peak fronting dalam suatu analisa dengan menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) merupakan hal yang sering kita jumpai.
Suatu peak dikatakan tailing jika jika memiliki asimetri > 1.2. Untuk mengetahui apa itu asimetri dan istilah lainnya silakan klik disini.
Peak tailing tersebut tentu ada sebabnya, dan berikut ini adalah diantaranya :
1. Guard coloum yang sudah mulai rusak.
2. Fase gerak yang mulai rusak.
3. Partikel silika ang dipakai di dalam bahan pendukung bukanlah partikel silika yang baik
4. Adanya komponen lain ang keluar tepat setelah peak.
Point nomor 4 tersebut dapat diatasi dengan cara memilih panjang gelombang alternatif atau dengan menggunakan lebih dari 2 panjang gelombang sekaligus untuk memonitor kromatogram.
Apabila ternyata peak tailing tersebut terjadi pada jika kita menggunakan kolom yang relatif baru maka kemungkinan disebabkan oleh hal berikut :
1. Sampel bereaksi dengan gugus silanol pada partikel silika
2. pH fase gerak yang tidak tepat
3. Pemilihan kolom yang tidak tepat dengan senyawa yang menjadi target analisa
4. Pelarut yang digunakan untuk melarutkan sampel tidak kompatible dengan fase gerak.
Peak fronting ini memiliki nilai peak asymetri kurang dari 0.8. Hal hal yang dapat menyebabkan peak menjadi fronting adalah sebagai berikut :
1. Overload pada coloum.
Jika sampel terlalu banyak / volume injeksi yang terlalu besar / konsentrasi sample terlalu pekat maka semua fase diam aktif pada kolom akan mengikat analit. Analit yang tidak terikat tersebut akan terbawwa kembali oleh fase diam mengalir menuju ketengah kolom dan terikat pada permukaan fase diam yang masih bebas.
2. Pelarut tidak sesuai dengan fase gerak.
3. Adanya komponen yang keluar tepat sebelum peak yang akan dideteksi.
4. Seting time constant yang kurang tepat.
Seting time constan sangat penting untuk mencegah adanya peak fronting dan tergantung dari beberapa faktor antara lain laju alir, panjang serta diameter kolom dsb.
Mudah-mudahan dengan sedikit gambaran diatas kita dapat mengatasi masalah jika terjadi adanya peak tailing dan peak fronting dalam suatu analisa dengan menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
