Mengenal Jenis Kromatografi dan Kolom HPLC

jenis kromatografi

Sebelum membahas lebih lanjut mengenai macam macam kromatografi ada baiknya kita mengenal lebih dekat dari kromatografi itu sendiri. Teknik kromatografi saat ini merupakan teknik pemisahan yang sangat populer dan banyak digunakan di laboratorium kimia modern entah itu metode kromatografi konvensional seperti kromatografi lapis tipis, kromatografi gas (GC), atau low presure chromatografi sampai dengan HPLC itu sendiri atau yang terkadang kita sebut dengan kromatografi Cair Kinerja TInggi (KCKT)

Kromatografi itu sendiri pertama kali diperkenalkan oleh Mikhail Tswet, seorang ahli botani yang berasal dari rusia pada tahun 1906. Dia melaporkan adanya pemisahan warna pigmen daun yang terjadi ketika dia melewatkan ekstrak daun tersebut melalui sebuah kolom yang diisi dengan calcium carbonat.

Secara sederhana HPLC aliran fase gerak (cair) dialirkan melalui suatu kolom dengan bantuan suatu pompa bertekanan tinggi, hal ini berbeda dengan prinsip dari kromatografi kolom dimana aliran dari fase gerak karena adanya pengaruh gaya grafitasi.

Jika dilihat dari interaksi antara fase gerak dan fase diam, macam macam kromatografi dapat dikelompokkan menjadi 5 golongan besar.

Jenis-Jenis Kromatografi

Kromatografi adsorbsi

Pada jenis ini, senyawa yang dianalisa terbawa oleh fase gerak terikat karena adanya interaksi dipol dipol dengan permukaan fase diam yang bersifat padat. Pemisahan terjadi karena setiap senyawa mempunyai kekuatan dipol yang berbeda sehingga molekul yang berbeda akan mempunyai waktu tinggal yang berbeda pula.

Fase diam dalam kromatografi ini merupakan fase diam padat, sedangkan fase gerak yang digunakan adalah dapat berupa fase gerak cair (liquid solid chromatografi) atau fase gerak gas (gas solid chromatografi). Kromatografi lapis tipis pada dasarnya adalah pengembangan dari kromatografi jenis ini.

Kromatografi Partisi

Kromatografi jenis ini menggunakan fase diam cair yang dilapiskan pada bahan pendukung padat (polimer / silika) sedangkan fase geraknya dapat berupa cair (liquid liquid chromatografi) ataupun gas (gas liquid chromatografi). Prinsip kerja dari kromatografi partisi adalah perbedaan kelarutan senyawa yang dianalisa dalam fase gerak dan fase diam.

Jika ditinjau dari polaritas fase gerak dan fase diam maka kromatografi ini dikelompokkan menjadi 2 yaitu :

  • Kromatografi partisi fase normal

Dimana fase diam lebih polar dibandingkan dengan fase geraknya. Hal ini menyebabkan senyawa yang lebih tidak polar akan memiliki waktu retensi yang lebih cepat dibanding senyawa yang lebih polar.

  • Kromatografi partisi fase terbalik

Yang tentunya kebalikan dari kromatografi fase normal.

Kromatografi partisi ini merupakan kromatografi yang paling luas penggunaanya untuk saat ini.

Kromatografi Pertukaran Ion

Seperti namanya kromatografi ini didasarkan adanya interaksi ion anatar ion yang berada dalam fase gerak dengan ion yang berada dalam fase diam. Ion ion tersebut akan mempunyai waktu tinggal yang berbeda di dalam kolom karena perbedaan kekuatan daya tarik.

Fase diam yang digunakan dalam kromatografi jenis ini umumnya adalah bahan pendukung silika gel / resin penukar ion yang dilapis dengan bahan yang bersifat ionik baik dengan gugus fungsional asam maupun basa.

Kromatografi pasangan ion

Kromatografi jenis ini adalah pengembangan dari kromatografi partisi dan alternatif bagi kromatografi pertukaran ion. Fase diam yang digunakan dalam kromatografi pertukaran ion sama dengan yang digunkana dalam kromatografi partisi fase terbailik.

Pada teknik kromatografi ini, kedalam sampel ditambahkan suatu senyawa organik ionik.\ yang akan mengikat senyawa yang ada di dalam sampel yang memiliki muatan berlawanan sehingga membentu suatu pasangang ion.

Kromatografi pemeasi gel

Pada kromatografi ini fase diam yang digunakan adalah suatu bahan porous yang dapat dilalui fase gerak yang bersifat cair. Senyawa dengan berat molekul kecil akan terperangkap di dalam pori pori fase diam sedangkan molekul dengan ukuran yang lebih besar akan keluar dari kolom terlebih dahulu.

Salah satu jenis kromatografi yang saat ini paling luas digunakan baik itu di laboratorium pendidikan untuk penelitian atau bahkan di berbagai macam jenis industri seperti industri famasi adalah HPLC karena mempunyai banyak keunggulan dan aplikasi yang sangat luas.

Secara besar unit alat HPLC ini terdiri dari beberapa bagian. antara lain sebagai berikut.

bagian alat hplc dan fungsinya

Wadah Fase gerak

Wadah ini baiknya mempunyai volume 2 – liter dan mempunyai sifat innert,

Pompa

Seperti halnya wadahnya, pompa juga harus bersifat innert, biasanya terbuat dari bahan gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam dan harus mampu memberikan tekanan sampai dengan 5000 psi serta mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit.

Kolom HPLC

Untuk kolom HPLC akan kita bahas lebih mendetil di ulasan di bawah ini karena merupakan bagian yang sangat penting dalam sistem HPLC itu sendiri.

Detector HPLC

Berfungsi untuk mendeteksi hasil analisa, detektor ini juga bermacam-macam jenisnya sesuai dengan zat yang akan kita analisa.

Kolom HPLC

Kolom HPLC merupakan bagian di dalam sistem HPLC dimana terjadi pemisahan senyawa yang dianalisa. Kolom tersebut saat ini tersedia dalam berbagai macam ukuran serta bahan-bahan pendukungnya. Hal ini lah yang menjadi tantangan terbesar oleh departemen riset untuk memilih suatu kolom sehingga analisa berjalan dengan efektif (dilihat dari segi waktu analisa yang tentunya berhubungan dengan terdeteksi nya peak oleh detektor karena waktu analisa yang lama tentu juga mengakibatkan cost fase gerak yang lebih banyak, serta bagaimana kolom tersebut mampu memisahkan senyawa yang dianalisa).

Umur dari kolom HPLC ini sangat tergantung dari berbagai hal misalnya kemurnian sampel, pH sampel, komposisi fase gerak serta perawatan kolom itu sendiri.

Hal mendasar dan wajib yang harus dilakukan untuk memperpanjang umur kolom ini adalah dengan menyaring sample yang akan dianalisa dengan menggunakan filter yang berukuran 0.45 mikron meter dengan bantuan pompa vacuum ataupun dengan syringe. Filter yang digunakan tersebut tentunya harus sesuai dengan senyawa yang dianalisa. Karena kesalahan dalam memilih filter ini akan berdampak pada tertahannya senyawan yang sebenarnya kita target untuk dianalisa di dalam filter tersebut. Konsultasi dengan vendor filter tersebut merupakan langkah yang bijak sebelum melakukan pemilihan filter karena mereka pasti mempunyai daftar dimana filter yang mereka jual compatible terhadap senyawa apa saja. Pemakaian guard coloum juga sangat dianjurkan untuk menghindari terjadinya akumulasi partikel dan bahan penggangu di dalam kolom itu sendiri.

Dengan dipakainya kolom HPLC secara terus menerus yang mungkin dapat menyebabkan kolom tersebut terakontaminasi tentu mengakibatkan kemampuan kolom tersebut menurun yang ditandai dengan hal hal sebagai berikut :

Indikasi Menurunnya Performa Kolom HPLC

1. Kromatogram yang terdeteksi oleh detektor mempunyai peak yang tiddak tajam

2. Resolusi kolom yang menurun

3. Terbentukknya peak bayangan / tailing

4. Peak yang terbelah

5. Waktu retensi yang berkurang

6. Tekanan balik yang tinggi

Hal tersebut diatas selain disebabkan oleh kolom HPLC yang terkontaminasi juga terkadang disebabkan oleh fase diam di dalam kolom yang telah rusak / larut / mengalami pemampatan. Secara umum kolom HPLC dengan ukuran bahan pendukung yang lebih kecil memerlukan penanganan yang ekstra hati hati dalam hal perawatannya.

Sama halnya dengan instrumen laboratorium lainnya, Kualifikasi / Kalibrasi HPLC ini tentunya sangat diperlukan untuk memastikan kinerja alat sesuai dengan persyaratan yang telah ditentukan. Untuk melakukan hal tersebut, teman-teman bisa kontak langsung ke supliernya atau juga bisa menggunakan laboratorium kalibrasi yang sudah biasa teman-teman gunakan atau juga bisa menggunakan layanan berikut.

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *