Di era seperti saat ini dimana kebutuhan analisa kimia terhadap suatu bahan / sampel semakin meluas maka dengan diimbangi perkembangan teknologi, banyak berbagai macam instrument tercipta dengan segala kelebihannya. Sebut saja kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC), gas chromatography (GC), spektrofotometer massa, spektrofotometer infra red, atau spektrofotometer UV visibel. Nah pada artikel ini kita akan sedikit belajar mengenai salah satu dari unit tersebut, yaitu spektrofotometer uv vis baik dari prinsip kerja, jenis, bagian-bagian, cara pemakaian, serta kalibrasi spektrofotometer uv visible tersebut.
Daftar Isi
Pengertian Spektrofotometer UV Vis
Spektrofotometer UV Vis adalah suatu instrumen yang digunakan untuk mengukur transmitansi atau absorbansi suatu sampel sebagai fungsi dari panjang gelombang. Pada spektrofotometer uv-vis ini terdapat dua konfigurasi yang biasa kita ditemukan, yaitu :
Spektrofotometer Single Beam (berkas tunggal)
Pada spektrofotometer jenis ini menggunakan satu berkas sinar yang digunakan secara bergantian untuk mengukur larutan standar (termasuk larutan blanko) dan larutan sampel. Jadi sinar tidak secara langsung menuju larutan standar dan larutan sampel secara bersamaan, namun satu-satu secara bergantian, larutan standar terlebih dahulu kemudian baru larutan sampel.
Skema instrumentasi spektrofotometer single beam (berkas tunggal)
Berikut ini adalah bagian-bagian dari spektrofotometer UV Vis single beam :
- Source atau sumber sinar
- Monokromator
- Sampel
- Detektor
- Sinyal processor
Dapat dilihat pada gambar diatas, yang membedakan antara spektrofotometer berkas tunggal dengan spektrofotometer berkas ganda adalah pada sinar hanya satu arah saja yang nantinya menyinari sampel dan blanko secara bergantian.
Spektrofotometer double beam (berkas ganda)
Spektrofotometer jenis ini menggunakan dua berkas sinar yang nanti masing-masing akan mengukur larutan sampel dan juga larutan standar.
Gambar diatas merupakan skema instrumen spektrofotometer berkas ganda (Double beam).
Berikut ini adalah bagian-bagian dari spektrofotometer double beam :
- Source atau sumber sinar
- Monokromator
- Chopper
- Sampel
- Detektor
- Sinyal processor
Dimana dapat dilihat sumber sinar setelah melalui monokromator akan dipecah oleh chopper sehingga nanti sinar yang terpecah ini yang satu akan masuk ke sampel dan yang satunya akan ke blanko atau bisa diilustrasikan ada dua jalur sinar.
Secara bagian-bagian / skemanya yang membedakan antara single beam dan double beam adalah karena adanya choper.
Fungsi Bagian-Bagian Spektrofotometer UV-Visible
Sumber sinar
Biasanya sebagai penghasil sinar polikromatis yang digunakan adalah lampu. Untuk spektrofotometer sinar tampak sumber emisinya adalah lampu sinar tampak, sedangkan untuk spektrofotometer UV, sumber emisi adalah lampu sinar UV.
Untuk lampu sinar tampak terutama lampu wolfram halogen biasanya juga memiliki sedikit spektrum UV dekat dan IR dekat, demikian juga untuk lampu UV biasanya memiliki sedikit spektrum sinar tampak. Sehingga biasanya spektrofotometer uv-vis digabungkan dalam satu bentuk menjadi spektrofotometer uv-visible.
- Contoh Sumber Emisi Sinar Tampak
Sinar tampak akan dihasilkan dari transisi elektron di kulit terluar atom, ion, atau molekul terutama dari transisi elektron n -> Π* (phi bintang) pada visible dan Π -> Π* pada UV. Foton pada frekuensi sinar tampak bisa dideteksi oleh mata dan dapat menghasilkan citra warna, contohnya, yang termasuk kedalam sumber emisi dari sinar tampak ini adalah lampu halogen dan lampu Wolfram.
- Contoh Sumber emisi Sinar UV
Sedangkan sinar uv memiliki panjang gelombang yang lebih pendek daripada sinar tampak, sehingga energi fotonnya lebih besar daripada energi foton dari sinar tampak. UV dihasilkan dari transisi elektron di kulit terluar atom, ion, atau molekul terutama dari transisi elektron Π -> Π*. Contoh yang digunakan sebagai lampu sinar UV adalah lampu deuterium, lampu Xenon.
Monokromator
Filter / Monokromator ini berfungsi untuk menghasilkan sinar yang relatif bisa dianggap sebagai monokromatis. Seperti yang telah diuraikan diatas, bahwa sinar yang dihasilkan oleh sumber emisi itu masih berupa sinar polikromatis sehingga tidak hanya memiliki satu panjang gelombang saja.
Atau dengan kata lain monokromator ini berfungsi sebagai media untuk menyeleksi sinar dengan panjang gelombang tertentu berdasarkan pada sifat serapan sinar (pada filter serapan), sifat retraksi sinar (pada prisma) dan interferensi gelombang (pada filter interferensi, kisi difraksi, kristal, dan interferometer), dan juga berdasarkan perbedaan energi foton (pada energy dispersive).
Sinar polikromatis yang ditembakkan pada monokromator ini nanti bisa dianggap sebagai sinar yang monokromatis.
Beberapa Jenis Monokromator
Monokromator Filter (Serapan dan Interferensi)
Monokromator filter ini berdasarkan pada prinsip penyerapan sinar yang tidak diperlukan (filter serapan) / interferensi internal (filter interferensi baji dan filter fabry perot), jadi monokromator hanya meneruskan sinar yang kita inginkan saja dan sinar yang tidak kita inginkan akan terfilter.
Monokromator filter ini biasanya lebih murah tetapi tidak fleksibel karena satu filter untuk menghasilkan satu lamda (λ) tertentu saja. Filter serapan biasanya dibentuk dari gabungan dua atau lebih bahan dalam bentuk kaca atau polimer berwarna.
Monokromator ini banyak digunakan pada fotometer (fotometer nyala, single channel, atau multi channel) dan spektrofotometer spesifik yang hanya untuk keperluan analit tertentu serta tidak cocok untuk spektrofotometer dengan lamda (λ) variabel.
Catatan Tambahan : Perbedaan Fotometer dengan Spektrofotometer
Ada perbedaan sedikit antara fotometer dengan spektrofotometer. Untuk fotometer sinarnya hanya satu panjang gelombang saja, sedangkan spektrofotometer sinarnya adalah polikromatis yang diseleksi pada panjang gelombang yang kita inginkan sehingga filter serapan ini lebih cocoknya untuk fotometer atau spektrofotometer spesifik karena dia hanya akan meneruskan lamda (λ) tertentu saja.
Monokromator Filter Intervensi – Interferensi Baji.
Monokromator yang dibentuk dari bahan dari sebuah bahan dielektrik transparan seperti misalnya CaF2 atau MgF2 diapit dua kaca semi cermin. Ketebalan dielektriknya menentukan lamda (λ) yang diteruskan.
Monokromator Prisma
Dimana sinar yang mengenai prisma akan direfraksikan menjadi beberapa sinar. Sama halnya dengan monokromator prisma yang ada pada spektrofotometer, jadi sinar polikromatis yang ditembakkan pada monokromator prisma akan mengalami refraksi menjadi beberapa panjang gelombang.
Monokromator prisma mempunyai kelebihannya harganya murah namun kualitas sinar monokromatis yang dihasilkan kurang bagus. Cocok digunakan untuk spektrofometer optik molekuler, namun tidak cocok untuk spektrofotometer optik atomik dan sering digunakannya pada spektrofotometer sinar tampak berkas tunggal yang sederhana.
Monokromator Grating / Kristal
Prinsipnya adalah seperti benda tajam mata pisau atau ujung jarum yang jika dikenai sinar maka akan menyebarkan sinar seolah-olah benda tersebut sumber-sumber sinar yang berukuran kecil.
Monokromator Interferometer / Michelson
Interferometer menghasilkan sinar monokromatis berdasarkan sifat dari interferensi gelombang. terutama digunakan untuk sinar inframerah.
Sel / Kuvet
Setelah sinar dirubah menjadi sinar monokromatis oleh monokromator, selanjutnya sinar akan menyinari sampel dalam wadah sampel / sel / kuvet.
Kuvet merupakan wadah larutan blanko, standar, atau sampel yang ditempatkan diposisi jalur sinar pengukur di dalam sebuah spektrofotometer. Kuvet model lama bentuknya adalah silinder seperti tabung reaksi kecil, namun kuvet yang berbentuk silinder mudah mengalami bias jika terjadi pergeseran bentuk atau pergeseran posisi sekalipun nilainya relatif kecil, sehingga dalam perkembangannya kuvet modern berbentuk persegi seperti gambar diatas.
Kuvet harus bersifat transparan sempurna untuk sinar pengukur yang digunakan. Untuk pengukuran menggunakan spektrofotometer visible, kuvet bisa dibuat dari bahan kaca biasa namun untuk sinar ultraviolet bahan kuvet harus terbuat dari borosilikat atau bahan lain yang tidak menyerap sinar UV, karena jika menggunakan bahan kaca biasa, maka kuvet tersebut akan ikut menyerap sinar.
Detektor
Setelah mengalami penyerapan sinar oleh sampel di bagian kuvet tadi, kemudian nanti sinar yang tidak diserap oleh larutan akan diteruskan pada detektor.
Beberapa Persyaratan detektor yang baik adalah :
- Harus memiliki kepekaan yang tinggi dalam daerah spektrumnya.
- Respon yang linear terhadap daya radiasi.
- Waktu Respon yang cepat.
- Dapat digandakan.
- Harus memiliki kestabilan yang tinggi atau tingkat noise yang rendah.
Jenis Detektor Spektrofotometer UV-VIS
- Detektor Sinar
- Detektor Foton
- Detektor Massa
- Detektor Felombang radio
Untuk detektor sinar ini berdasarkan daya / power sinar, contohnya digunakan pada spektrofotometer inframerah, UV dan sinar tampak. Prosesnya adalah sinar mengenai sampel yang ada di kuvet, kemudian sampel akan menyerap sinar, dan sinar yang tidak diserahkan itu diteruskan dan akan dideteksi oleh detektor. Detektor jenis ini yang biasa digunakan pada spektrofotometri uv-vis.
Adapun detektor-detektor yang lain (foton, massa, gelombang radio) biasa digunakan pada spektrofotometer yang lain, misalnya detektor foton untuk spektrofotometer sinar X, detektor massa untuk spektrofotometer massa, detektor radio untuk spektrofotometer resonansi magnet inti).
Sinyal Prosesor
Setelah detektor mendeteksi adanya sinar tersebut, sinar ini tidak langsung diolah namun harus melewati terlebih dahulu sinyal prosesor. Pada sinyal prosesor ini diantaranya akan terjadi penguatan sinyal. Pada bagian ini terdapat pre amplifier, terutama untuk menguatkan potensial dan amplifier yang berfungsi untuk menguatkan daya.
Amplifier diperlukan untuk menguatkan sinyal agar bisa menggerakkan sistem pembacaan karena bisa jadi sinyal tersebut belum cukup besar untuk menggerakkan sistem pembacaan sehingga diperlukan amplifier.
Umumnya sistem pengolahan sinyal analitik tidak diperlukan daya keluaran yang tinggi namun harus stabil. Pada instrumen analitik yang lama, biasanya sistem pembacaannya menggunakan sistem numerik atau jarum, sinyal tersebut akan terlihat dari pergerakan jarum, namun saat ini sudah banyak yang menggunakan sistem komputerisasi sehingga keluaran instrumen analitiknya sudah berbentuk sinyal digital yang diteruskan pada komputer.
Beam Splitter atau Pemecah Berkas
Beam Splitter ini dibentuk oleh dua prisma siku-siku sama kaki atau cermin 50 % yaitu hanya 50 % permukaan kaca tertutup oleh lapisan perak berbentuk cermin.
Jadi nanti ketika sinar ditembakkan nanti sinarnya akan terpecah masuk ke blanko dan masuk ke sampel.
Bentuk lain yang digunakan sebagai pemecah sinar ini adalah chopper / cermin berputar yang akan membagi sinar menjadi 2, salah satu melewati blanko disebut juga reference beam dan yang lainnya melewati larutan. Gambar dibawah ini merupakan contoh gambar chopper.
Beam splitter / chopper ini hanya terdapat di dalam spektrofotometer double beam.
Sistem komputerisasi
Ada dua jenis sistem komputerisasi pada spektrofotometer:
- Interaksi passive
Komputer hanya digunakan untuk penanganan data seperti memproses, menyimpan, mencari, menampilkan.
- Interaksi aktif
Komputer dapat mengontrol langkah-langkah pengoperasian instrumen contohnya : memilih panjang gelombang, menghidupkan, mengatur intensitas sinar, mengatur jumlahnya sampel, dll.
Namun jika pengaturan parameter kerja melalui komputer tetapi tidak otomatis maka dinamakan dengan semi aktif.
Langkah Awal Menggunakan Spektrofotometer Uv Visible
Gambar diatas bisa dikatakan bagian utama dari spektrofotometer UV Vis dimana blanko dan sampel ditempatkan. Jadi untuk meletakkan kuvet blanko di tanda huruf d blanko, sedangkan nomer 1 s/d 5 merupakan tempat sampel. Terkait dengan sumber daya listrik, untuk peralatan spektrofotometer uv vis ini sebaiknya menggunakan stabilizer dengan tujuan menjaga listrik tetap stabil serta menyimpan daya ketika terjadi mati lampu.
Tahapan Awal Dalam Pengoperasian Spektrofotometer UV Vis Adalah :
- Nyalakan terlebih dahulu stabilizer.
- Kemudian tekan tombol “ON” dibagian belakang spektrofotometer UV Vis sehingga display menyala, sebelum melakukan pengukuran sebaiknya kita tunggu sekitar 30 menit setelah tombol ON dinyalakan.
- Sebelum kuvet dimasukkan ke dalam spektrofotometer, sterilkan kuvet terlebih dahulu dengan cara membilas dengan larutan sampel dan diulangi sebanyak 3 x.
- Lap bagian luar kuvet dengan tisue dengan cara menempelkan tisue ke dinding-dinding kuvet agar kuvet tidak mengalami goresan. Kuvet ini terdiri dari dua bagian, bagian yang sisinya agak buram dan bagian yang sisinya bening. Yang perlu diperhatikan adalah jangan kita sentuh dengan tangan pada sisi bagian yang bening tersebut, namun kita boleh menyentuhnya di bagian yang buram.
- Isi kuvet dengan aquades, untuk pengisian pada kuvet kita tidak perlu mengisinya sampai penuh namun cukup sampai tanda batas yang ada dalam kuvet tersebut.
- Buka tutup spektro, letakkan kuvet tersebut ke dalam blanko, pada saat meletakkan kuvet yang perlu diperhatikan adalah bagian terang dari kuvet harus menghadap ke lubang karena cahaya spektrofotometer uv vis akan ditembakkan melalui lubang tersebut.
- Kemudian isi kuvet yang lain dengan larutan sampel, dan masukkan di tempat nomer 1.
- Lakukan hal yang sama untuk sampel yang kedua jika ada.
- Tutup spektrofotometer secara perlahan.Untuk tahapan pengukuran absorbansi, dll tentunya disesuaikan dengan pengoperasian masing-masing merk / tipe spektrofotometer uv vis tersebut. Video dibawah ini merupakan salah satu contoh cara menggunakan spektrofotometer uv vis.
Prinsip Kerja Kalibrasi spektrofotometer UV Visible
Paling tidak ada 3 tahapan yang harus diperhatikan sebelum melakukan kalibrasi spektrofotometer UV Vis, yaitu :
Pemeriksaan awal
- Sebelum kalibrasi dimulai lakukan pemeriksaan visual bahwa spektrofotometer berfungsi dengan baik, setiap kekurangan yang ditemukan harus dicatat dan dievaluasi untuk memastikan bahwa hal tersebut tidak mempengaruhi kinerja spektrofotometer.
- Lakukan pengecekan nilai Stray Radiant Energy (SRE) atau kebocoran cahaya yang tidak diinginkan dengan menggunakan filter SRE pada daerah 200 nm sampai 450 nm.
- Bila diperlukan lakukan pengukuran base line flatness dan noise dari instrumen.
- Selama proses kalibrasi, suhu lingkungan disekitar spektrofotometer harus dipantau dan dicatat serta tidak keluar dari rentang 23 plus minus 3,0 derajat Celcius. Bila pengukuran dilakukan pada kondisi suhu di luar terus tersebut maka koreksi terhadap pengaruh suhu harus dipertimbangkan.
Persiapan alat
Kalibrasi dilakukan menggunakan filter standar baik berupa larutan atau glass. Untuk itu filter standar yang akan digunakan harus dibersihkan terlebih dahulu dengan menggunakan penghembus udara (air blower) untuk memastikan tidak ada debu dan kotoran di permukaan filter standar. Apabila terdapat kontaminasi pada permukaan filter standar bersihkan menggunakan kain bebas serat atau mikrofiber.
Kalibrasi spektrofotometer UV Visible
Kualifikasi kinerja spektrofotometer mengikuti dua kriteria yang harus diverifikasi menggunakan filter standar saat kalibrasi. Kriteria-kriteria tersebut adalah :
- Akurasi penunjukan panjang gelombang.
Akurasi bukan panjang gelombang didefinisikan sebagai penyimpangan penunjukan panjang gelombang pada rentang panjang gelombang serapan atau emisi dari nilai panjang gelombang pada rentang yang telah diketahui.
- Fotometrik akurasi
Nilai Fotometrik akurasi ditentukan dengan membandingkan hasil pengukuran nilai acuan absorbansi atau transmittance baik berupa glass ataupun Larutan kimia dengan nilai yang sudah ditentukan dalam sertifikat.
Kenapa Kalibrasi Spektrofotometri uv-vis?
Menurut jurnal Indonesian of laboratory volume 1 nomor 2 tahun 2019 tujuan kalibrasi adalah untuk menyampaikan telusuran pengukuran, maka tujuan kalibrasi spektrofotometer adalah untuk mengetahui nilai perbedaan dari pembacaan alat dengan membandingkan nilai standar, sehingga dapat menjamin data yang benar dan valid. Berikut ini adalah beberapa alasan dilakukan kalibrasi spektrofotometer uv vis :
- Agar alat spektrofotometer dapat digunakan dengan baik atau menghasilkan data yang valid
- Untuk mengetahui letak kesalahan atau kerusakan secara dini sehingga dapat diperbaiki sebelum alat mengalami kerusakan berat.
Akurasi panjang gelombang
Akurasi penunjukkan panjang gelombang didefinisikan sebagai penyimpangan penunjukkan panjang gelombang pada rentang panjang gelombang serapan atau emisi dari nilai panjang gelombang pada rentang yang telah diketahui. Penyimpangan panjang gelombang dapat menyebabkan kesalahan yang signifikan pada hasil pengukuran kualitatif dan kuantitatif.
Apabila spektrofotometer di dalam mempertahankan skala panjang gelombang yang akurat maka profil penyerapan sampel yang diukur oleh instrumen spektrofotometer akan tidak akurat, maka harus melakukan verifikasi akurasi panjang gelombang pada spektrofotometer uv-vis.
Nilai akurasi fotometri
Ditentukan dengan membandingkan hasil pengukuran nilai acuan absorbansi atau transmitan baik berupa glass ataupun larutan kimia dengan nilai yang sudah ditentukan dalam sertifikat, karena nilai absorbansi dibatasi oleh tingkat linear hasil pembacaan nilai tersebut maka pada sebuah spektrofotometer ketika didapatkan perbedaan hasil pengukuran dari nilai absorbansi dengan nilai sertifikat maka perlu dilakukan koreksi. Nilai koreksi ini pada umumnya didapatkan dengan membuat plot grafik dan kemudian melakukan perhitungan interpolasi linier.
Performa spektrofotometri uv-vis secara langsung mempengaruhi kualitas pengukuran dan bergantung pada fungsi konfigurasi optik internal yang tepat sehingga dapat diverifikasi oleh penilaian berbagai parameter.
Manfaat pelaksanaan kalibrasi spektrofotometer untuk mengetahui unjuk kinerja instrumen apakah masih sesuai dengan standar yang dipersyaratkan atau tidak serta mengetahui nilai perbedaan dari pembaca alat dengan membandingkan nilai standar sehingga dapat menjamin data benar dan valid. Dengan mengetahui unjuk kinerja alat maka akan dapat menjamin mutu hasil data pengukuran dalam kegiatan penelitian, maupun pengujian.
Manfaat lainnya adalah untuk mengetahui letak kesalahan atau kerusakan secara dini sehingga dapat diperbaiki sebelum alat mengalami kerusakan berat.
Durasi / Interval kalibrasi spektrofotometer
Dalam menentukan interval untuk melakukan kalibrasi harus dilihat terlebih dahulu dari alat itu sendiri mulai dari umur alat, kinerja alat, dan juga rekomendasi pabrik pembuat alat tersebut.
Selain itu jangka waktu pemakaian hingga cara perawatannya juga menjadi tolak ukur dalam menentukan waktu kalibrasi penentuan waktu kalibrasi sebenarnya bisa diperkirakan misal alat ukur harus dikalibrasi zat mencapai 400 jam penggunaan atau setahun sekali dari masa pemakaian agar keakuratannya selalu terjaga.
Biaya dan resiko terkait dengan alat yang tidak dikalibrasi bisa jauh lebih tinggi daripada biaya pada alat yang terkalibrasi, oleh karena itu disarankan bahwa alat tersebut dikalibrasi secara teratur.
Untuk melakukan kalibrasi jika mempunyai standarnya bisa dilakukan sendiri dengan mengikuti manual book yang disertakan pada saat pembelian, namun pastikan personel yang melakukan sudah mengikuti training kalibrasi untuk menjamin kompetensinya.
Semoga bermanfaat.
Referensi :
Kalibrasi Alat Spektrofotometer
Instrumentasi Spektrofotometer UV VIs
Cara Penggunaan Spektrofotometer UV Vis
